Esta vez su historia nos narra cómo Mario, Luigi, Peach y varios Toad son invitados a un hotel de lujo para pasar unas buenas y merecidas vacaciones. Sin embargo, las cosas no tardan en torcerse cuando en la primera noche descubren que el edificio está encantado y regentado por fantasmas, quienes han atraído a nuestros héroes para que el Rey Boo pueda tomarse su ansiada venganza encerrándolos a todos en cuadros espectrales.

Por suerte, Luigi consigue evitar este destino, convirtiéndose en la última esperanza de su hermano y de sus amigos al emprender una misión de rescate en la que contará con la ayuda del extravagante Profesor Fesor y de la nueva y mejorada Succionaentes GOM-1L, una aspiradora multiusos con la capacidad de atrapar espíritus. Así pues, deberemos explorar todas y cada una de las plantas del hotel mientras nos enfrentamos a multitud de espectros, resolvemos infinidad de elaborados puzles y amasamos una fortuna recogiendo los tesoros que encontremos.